第五章 蛋白電泳

                                     第五章 蛋白電泳




5.1  SDS-PAGE 基本原理

1. SDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入 SDS 和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS 是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.  強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與 SDS 充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物。

3.  蛋白質(zhì)分子結(jié)合 SDS 陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。

5.2  PAGE：聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰胺（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑（crosslinker)N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱 Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素 AP）和加速劑（四甲基乙二胺 TEMED）作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。化學(xué)惰性強(qiáng)，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和透明度。是良好的電泳介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠聚合機(jī)理是通過提供氧游離基（free radicals）的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用(catalyst-redox systems)來完成的。催化體系主要有化學(xué)催化（AP-TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素-TMTED）體系。

                                      

5.3 聚丙烯酰胺凝膠分類

   PAGE 分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液 pH 值與凝膠中的相同。帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中帶電顆粒在電場中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。

                                         

不連續(xù)系統(tǒng)的濃縮效應(yīng)：

凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠的孔徑大，分離膠的孔徑小。在電場的作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠中遇到的阻力小，移動(dòng)快。而在小孔膠中遇到的阻力大，移動(dòng)慢。因此，在兩層凝膠的交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。緩沖液離子成分和pH的不連續(xù)性：HCl易解離出Cl-，它在電場中遷移率大，走在zui前面，故稱為快離子或前導(dǎo)離子。電極緩沖液中的甘氨酸在pH6.8 的緩沖液中解離度很小，僅為 0.1-1%，因而在電場中遷移率很小，稱為慢離子或尾隨離子。蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，在電場中均移向正極，其有效遷移率介于快慢離 子之間，于是蛋白質(zhì)就在快慢離子間形成的界面處，被濃縮成極窄的區(qū)帶。當(dāng)進(jìn)入pH8.8的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)，因此氯離子和甘氨酸離子沿著離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面，然后分離成多個(gè)區(qū)帶。